譯文來(lái)源：Patricia M. Gundy, Charles P. Gerba，Ian L. Pepper. Survival ofcoronaviruses in water and wastewater[J].Food Environ Virol,2009,1(1):10–14.
翻譯：哈爾濱工業(yè)大學(xué) 王路遙;校對：哈爾濱工業(yè)大學(xué)陳志強教授，西湖大學(xué) 鞠峰教授(備注：疫情時(shí)期，本文的翻譯是為了使大家更好地了解風(fēng)險防控知識，如有不當之處，請批評指正)
摘要：嚴重急性呼吸綜合征的出現及其潛在的環(huán)境傳播表明，需要更多關(guān)于冠狀病毒在水和廢水中存活的信息。在過(guò)濾和未過(guò)濾的自來(lái)水(4℃和23℃)和廢水(23℃)中測定了代表性冠狀病毒貓傳染性腹膜炎病毒和人冠狀病毒229E的存活率。在相同的試驗條件下，將其與脊髓灰質(zhì)炎病毒1型進(jìn)行了比較。試驗水中冠狀病毒的失活高度依賴(lài)于溫度、有機物水平和拮抗細菌的存在。病毒效價(jià)下降99.9% (T99.9)所需的時(shí)間表明，在自來(lái)水中，冠狀病毒在23℃ (10天)水中比在4℃ (>100天)水中滅活得更快。冠狀病毒在廢水中迅速死亡，T99.9值在2～4天之間。除了4℃自來(lái)水外，脊髓灰質(zhì)炎病毒在所有測試水中的存活時(shí)間都比冠狀病毒長(cháng)。
01
介紹
2003年嚴重急性呼吸系統綜合癥(SARS)在全世界造成了8000多例病例產(chǎn)生，死亡率約為10%(Manocha et al. 2003;Centers for Disease Control 2004)。最后已知的爆發(fā)是在2004年北京的一個(gè)研究實(shí)驗室。這種疾病的原因被確定為一種新的人類(lèi)冠狀病毒，很可能起源于麝貓，潛在宿主可能是蝙蝠(Guan et al. 2003; Lau et al. 2005; Wang et al. 2006)。冠狀病毒是有包膜的單鏈RNA病毒，大小從60～220納米不等。它們可以感染鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物，包括人類(lèi)，并通過(guò)氣溶膠或糞便-口腔途徑傳播。冠狀病毒在爆發(fā)期間的迅速傳播表明，人類(lèi)冠狀病毒的主要傳播方式是呼吸道飛沫;然而，沒(méi)有直接證據支持這一點(diǎn)(Belshe 1984)。由于迄今為止人類(lèi)冠狀病毒感染被認為是一種溫和的、自我限制的疾病，因此關(guān)于其在環(huán)境中的傳播潛力的信息有限。
鑒于2003年3月在香港高層住宅區爆發(fā)的涉及300多人的SARS疫情與一個(gè)有缺陷的污水系統有關(guān)(Peiris et al. 2003)，SARS疫情傳播可能與水和廢水有關(guān)。SARS-CoV可在腸道內復制 (Leung et al. 2003)，這一事實(shí)使其成為一種可能的腸道病原體，而SARS病例中腹瀉的發(fā)生率在8%～73%之間(SARS流行病學(xué)工作組，2003)，這引起了人們對其潛在環(huán)境傳播的關(guān)注。Leung等人(2003)還報道，從SARS患者小腸中獲得的病毒培養物產(chǎn)量高于作為該病毒靶器官的肺組織。傳染性病毒是從SARS患者感染后3周內的糞便中分離出來(lái)的(Chan et al. 2004; Liu et al. 2004)。SARS的出現及其傳播問(wèn)題表明需要更多的信息，特別是冠狀病毒在水和廢水中的存活情況。本研究比較了代表性冠狀病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒1型在自來(lái)水和廢水中的存活情況。
02
材料和方法
貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV) (ATCC-990)：一種貓科動(dòng)物的腸道冠狀病毒，在克蘭德?tīng)柪锷埬I細胞系(CRFK) (ATCC-94)中繁殖和檢測。人冠狀病毒229E (HCoV) (ATCC-740)：一種呼吸道病毒，在胎兒肺成纖維細胞，MRC-5細胞系(ATCC-171)中繁殖和分析。脊髓灰質(zhì)炎病毒1 LSc-2ab (PV-1)：一種已知的在環(huán)境中非常穩定的人類(lèi)腸道病毒，在布法羅綠猴腎(BGM)細胞系中繁殖和檢測。在單層細胞中觀(guān)察到細胞致病作用(CPE)后，將感染細胞在-20℃冷凍和解凍三次以釋放病毒。隨后在1000g離心10分鐘以除去細胞碎片，加入到9%聚乙二醇(相對分子質(zhì)量8000)和0.5 M氯化鈉的病毒懸浮液中，并在4℃下攪拌過(guò)夜。在10000g離心30分鐘后，用0.01 M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS; pH 7.4)(Sigma, St. Louis, MO)重懸至原始病毒懸液體積的5%。然后將冠狀病毒進(jìn)行效價(jià)測定并儲存在-80℃下。脊髓灰質(zhì)炎病毒通過(guò)用等體積的Vertrel XF (Dupont, Wilmington，DE)提取進(jìn)一步純化，乳化后以7500g離心15分鐘，隨后收集頂層水層，進(jìn)行效價(jià)測定并在-80℃儲存。
自來(lái)水樣本是從實(shí)驗室的冷水龍頭中采集的。水源是地下水，水質(zhì)參數: pH 7.8，溶解固體297mg/L，總有機碳0.1mg/L。在收集樣品之前，讓水流動(dòng)3分鐘。在未過(guò)濾的自來(lái)水和通過(guò)0.2μm孔徑過(guò)濾器去除細菌的自來(lái)水中測定病毒存活率。將自來(lái)水(30mL)加入到無(wú)菌的50mL聚丙烯離心管中，以減少附著(zhù)在容器上的病毒損失。添加無(wú)菌硫代硫酸鈉至最終濃度33μg/mL，以使水脫氯。渦旋后，將病毒添加到每個(gè)管中，最終濃度為105 TCID50/mL。再次渦旋離心管并立即取樣(零時(shí)間點(diǎn))。然后將離心管儲存在4℃或室溫下(23℃)。室溫下儲存的離心管用鋁箔覆蓋，以防暴露在光線(xiàn)下。在1、3、6、10、15和21天后對離心管取樣，并將樣品在-80℃下冷凍，直到它們在細胞上被分析。 初級出水和剩余活性污泥(二級)的樣品來(lái)自于美國亞利桑那州圖森市羅杰路污水處理廠(chǎng)，并收集在無(wú)菌聚丙烯瓶中。沉淀后收集初級出水，氯化前收集二級出水。該設施一級出水的典型水質(zhì)參數為生物需氧量(BOD)和1懸浮固體(10～220mg/L)。通常相比初級出水，二級出水中的BOD和懸浮固體減少了90%～95%。將出水(30mL)加入到無(wú)菌的50mL聚丙烯離心管中。在添加病毒之前，一級出水通過(guò)0.2μm孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾，并且未經(jīng)過(guò)濾的也進(jìn)行測試。二級出水僅未經(jīng)過(guò)濾的進(jìn)行測試。然后將病毒添加到每個(gè)離心管中，最終濃度為105 TCID50/mL。將離心管渦旋，立即取樣(零時(shí)間點(diǎn))。然后將離心管覆蓋并保持在室溫(23℃)。在1、2、3、6、10、15和21天后收集樣品，并將樣品在-80℃下冷凍直至分析。 使用噬斑試驗或TCID50技術(shù)在細胞培養物上計數病毒。在6孔塑料細胞培養板中，通過(guò)噬斑測定法(Payment and Trudel 1993)測定了PV-1的效價(jià)。這是一種直接定量方法，最低檢測限為10 pfu/mL。將每種稀釋液接種在兩個(gè)孔中。在細胞培養中不形成斑塊的冠狀病毒，通過(guò)組織培養感染劑量50%技術(shù)(TCID50)在24孔塑料細胞培養板中測定其效價(jià)(Payment and Trudel 1993)。這種技術(shù)確定了顯示出CPE的50%的原液的稀釋度。取稀釋倍數的反對數，得到每毫升TCID50的病毒效價(jià)。該方法的最低檢測值為每毫升3.7個(gè)病毒。將每種稀釋液接種在至少8個(gè)孔中。在添加病毒之前，任何來(lái)自測試水的樣品都必須在細胞培養檢測之前過(guò)濾，以消除細菌污染。在pH為7下使3%牛肉提取物(Becton Dick-inson，Sparks，MD)通過(guò)以阻斷可能吸附病毒的位點(diǎn)來(lái)制備具有聚醚砜(PES)膜的0.2 μm低蛋白結合Millex過(guò)濾器(Millipore, Billerica, MA)。所有實(shí)驗重復三次。
03
結果和討論
表1顯示了三種病毒在測試水中的存活天數。每種病毒的對數減少量由公式“lg N/N0”計算，其中N是指定日期的病毒效價(jià)，N0是時(shí)間為0的病毒效價(jià)。線(xiàn)性回歸的斜率用于確定存活率;病毒效價(jià)下降99%和99.9%所需的時(shí)間(分別表示為T(mén)99和T99.9)。
影響病毒在水中存活的因素包括溫度、有機物和好氧微生物(John and Rose 2005; Melnick and Gerba 1980; Sobsey and Meschke 2003)。對病毒存活最關(guān)鍵的影響因素就是溫度。已有研究表明，病毒存活率隨著(zhù)溫度的升高而降低，這主要是由蛋白質(zhì)變性和胞外酶活性增加引起的(Hurst et al. 1980; John and Rose 2005)。自來(lái)水研究的結果證實(shí)冠狀病毒就是這種情況。通過(guò)測試過(guò)濾后的自來(lái)水，我們減少或消除了顆粒有機物和細菌的影響。在室溫下，只需要10天就能使過(guò)濾后的自來(lái)水中的冠狀病毒減少99.9%，而在4℃時(shí)，這種程度的病毒滅活則需要100天以上。PV-1在自來(lái)水中4℃的存活與冠狀病毒相似，但在室溫(23℃)下，該病毒在過(guò)濾水和未過(guò)濾水中的存活時(shí)間都延長(cháng)了六倍。圖1和圖2分別顯示了三種研究病毒在室溫(23℃)和4℃下在自來(lái)水中的存活情況。隨著(zhù)時(shí)間的推移，病毒效價(jià)從4℃水中的初始效價(jià)上升，這可能是由于病毒傾向于形成聚集物然后分解，而不是由于病毒在樣本中的復制。
圖1 室溫(23℃)條件下三種病毒在脫氯、過(guò)濾后自來(lái)水中的對數減少量
圖2 4℃條件下三種病毒在脫氯、過(guò)濾后自來(lái)水中的對數減少量(*代表未過(guò)濾)
水中有機物和懸浮固體的存在可以為吸附在這些顆粒上的病毒提供保護，但同時(shí)如果這些固體沉淀下來(lái)，也可以成為去除病毒的一種機制。從自來(lái)水到二級出水再到一級出水，測試水中的有機物和懸浮固體含量都有所增加。過(guò)濾后的自來(lái)水比未過(guò)濾的自來(lái)水對冠狀病毒滅活作用更強。此外，HCoV在未過(guò)濾的一級出水中的存活時(shí)間比過(guò)濾后的長(cháng)。這表明較高的固體含量確實(shí)為水中的冠狀病毒提供了保護。然而，對PV-1來(lái)說(shuō)，過(guò)濾對其在自來(lái)水中的存活影響很小。在一級出水中，經(jīng)過(guò)濾出水中的PV-1存活時(shí)間是未經(jīng)過(guò)濾出水中的三倍。值得注意的是，在添加到廢水中的時(shí)間和立即回收用于測試的時(shí)間(零時(shí)間點(diǎn))之間，冠狀病毒的效價(jià)顯著(zhù)降低。加入廢水后，冠狀病毒的效價(jià)立即下降了99.9%，而PV-1效價(jià)僅下降了10%。這種減少可能是由于廢水中溶劑和洗滌劑的存在，它們會(huì )破壞病毒包膜并最終使病毒失活。這也可能表明冠狀病毒比PV-1更容易吸附廢水中的固體。病毒包膜的疏水性使得冠狀病毒在水中的溶解性降低，因此增加了這些病毒粘附在固體上的可能性。廢水樣本必須經(jīng)過(guò)過(guò)濾，以防止細菌污染細胞單層，這將去除顆粒物和任何與之相關(guān)的病毒。
捕食性微生物如原生動(dòng)物的存在可以增加水中病毒的失活率，蛋白酶和核酸酶也有這種作用(Gerba et al. 1978; John and Rose 2005)。與二級出水相比，初級出水的細菌和固體含量都較高。所有三種測試病毒在未過(guò)濾的初級出水中的存活時(shí)間都比未過(guò)濾的二級出水長(cháng)，盡管對FIPV來(lái)說(shuō)這是可以忽略的。這再次表明，廢水中的顆粒物相關(guān)病毒受到保護，不會(huì )被捕食和滅活。然而，冠狀病毒在3天后低于最低檢測限，而PV-1在21天后仍可檢測到。廢水中研究病毒的平均對數減少結果列于表2。
04
結論
這項研究的結果表明，冠狀病毒比PV-1對溫度更敏感，并且PV-1和冠狀病毒在廢水中的存活性有相當大的差異。其部分可能原因是包膜病毒在環(huán)境中不如非包膜病毒穩定。冠狀病毒在廢水中很快死亡，在2～3天內減少了99.9%，這與SARS-CoV存活數據相當(Wang et al. 2005a, b)。冠狀病毒在初級出水中的存活時(shí)間僅略長(cháng)于二級出水，這可能是因為懸浮固體含量較高，可以防止其失活。PV-1比冠狀病毒存活時(shí)間長(cháng)得多，初級出水需要10天，二級出水需要5天，才能達到與冠狀病毒相當的滅活率。本研究表明，冠狀病毒在水環(huán)境中的傳播要比腸道病毒少，因為在環(huán)境溫度下，冠狀病毒在水中和廢水中會(huì )更快地失活。
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